작성일 : 16-08-10 14:52
Minimal cell 연구 현황 및 전망-BioinPro
 글쓴이 : 도정태
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Minimal cell 연구 현황 및 전망

저자한민지, 서봉종, 도정태 소속건국대학교
발간일2016-08-05
발행호2016년 BioINpro 26호
       

 

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1. Minimal cell의 개요


 가. Minimal cell 연구의 시작


  1990년에 시작되어 2003년 완료된 인간게놈프로젝트는 인간의 유전체를 구성하는 30억 염기서열을 밝히고, 이 데이터에 포함되어 있는 모든 유전자를 찾아내어 유전자 지도를 완성하는 것을 목표로 하는 거대한 프로젝트였다. 이 프로젝트를 통해서 인간의 염기서열 전체를 밝히는 목표는 달성 하였지만, 단순히 DNA 염기서열로 이루어진 데이터베이스는 그 이용가치가 예상보다 크지 않았다. 그리고 과학자들은 염기서열에 함축된 유전자의 기능과 데이터를 해석하기 위한 다양한 방법을 고안하게 되었다.

 

  현대 생물학의 목표 중 하나는 세포 안에 존재하는 유전자와 유전자들의 기능간의 복잡한 관계를 규명하는 것이다. 최근 이 목표를 달성하기 위해 생물학 뿐 아니라 생물정보학, 생물물리학, 생화학, 의학, 약학 등의 분야에서도 다방면의 노력을 기울이고 있다. 그 중에 가장 흥미로운 분야 중 하나가 Minimal cell이라는 합성세포 연구이다. 과학자들은 ‘생명 활동에 필요한 최소한의 유전자만 가지고 있는 유전체’를 합성하고, 이 유전체를 작은 단세포 생명체(유전자가 제거된)에 도입한 ‘Minimal cell’이라는 새로운 인공 생명체를 합성하였다. Minimal cell은 생명체 진화과정의 초기로 되돌아가 세포의 진화와 유전자 기능을 밝히기 위해 가장 선행되었어야 할 연구 방법이었을지도 모른다. 단지 그 기술이 최근에서야 가능해 졌기 때문에 늦어 졌을 뿐일 것이다.

 

 나. Minimal cell 연구의 목표와 평가


  최근 각광받고 있는 크리스퍼 유전자가위(CRISPR-Cas9)가 유전체에 존재하는 특정 유전자를 편집하여 그 유전자의 기능을 알아보는 데에 목표를 두고 있다고 한다면, Minimal cell은 이와 반대로 최소한의 유전자를 가진 생물체에 기능이 밝혀지지 않은 유전자를 도입하여 그 기능을 알아보는 데에 목표를 두고 있다고 할 수 있다.
 
  막대한 연구 자금과 연구 인력 그리고 시간이 투입된 이 프로젝트는 관련 논문과 기사들에서 대부분 ‘획기적이다’라는 긍정적인 평가를 받고 있다. 하지만 이 인공세포가 인체나 환경에 어떠한 영향을 미칠지는 아무도 예상할 수 없기 때문에, 이와 관련된 연구를 진행하는 전문가들의 우려 또한 적지 않다. 한편으로는 사람이 직접 유전체를 설계하기 때문에 종교적인 차원에서의 윤리적인 문제 또한 제기되고 있는 실정이다.
 


2. Mycoplasma와 Minimal Cell의 초기 단계


 가. Mycoplasma


  과학자들은 세포벽이 결여되어 유전체의 도입이 용이한 Mycoplasma가 Minimal gene set를 알아낼 수 있는 가장 적합한 실험모델이 될 것이라고 생각했다 [1, 4]. 이들은 Mycoplasma 중에서 독립생활을 하는 생명체 중 가장 작은 유전체를 가진  성 접촉을 통해 전염되는 미생물 M.genitalium을 첫 번째 실험 대상으로 선택했다. 대부분의 Bacteria는 평균적으로 유전자 중 26%가량이  조상 유전자의 중복이나 그에 이어지는 변이의 결과 유사 유전자(Paralogous gene) 인 반면, M.genitalium은 유전자의 6%만이 유사 유전자이기 때문에  한 생물의 유전체에 같은 기능을 하는 여러 개의 유전자가 존재 하는 것. Genomic redundancy가 적고, 다른 환경 조건에서 유전자의 변이가 일어날 가능성이 적은 특징을 가지고 있다 [4].
 
  하지만 M.genitalium은 16시간이나 되는 긴 doubling time을 가지고 있기 때문에, 실험을 한 번 진행하는데 몇 주 정도가 소요되었다. 이러한 이유로 M.genitalium은 유전체의 크기는 더 크지만 상대적으로 훨씬 더 빨리 증식하는  반추동물에 기생하는 미생물로 doubling time은 1시간으로 보고됨.


M.mycoides로 교체되었다 [10]. 그리고 2009년 Modified Bacteria의 유전체 이식이 시작되면서 공여자 세포인 M.mycoides와 가장 유사하다고 알려진 M.capricolum가 수용자 세포로 선정되었다 [9].

 

 나. Minimal Cell의 초기 단계 (~JCVI-syn 1.0)


  1995년 크레이그 벤터(Craig Venter) 박사가 Science지에 발표한 M.genitalium 유전체 시퀀싱 데이터 분석을 통해 Minimal cell에 대한 개념이 구체화되기 시작했다. 이는 초기 Minimal cell 연구에 있어 매우 중요한 발판이 되었다. 1999년 벤터 박사는 60만 염기쌍 정도 되는 M.genitalium 유전체 내에 있는 유전자를 하나씩 불활성화 시키는 방법을 통해 단백질을 코딩하는 480개의 유전자 중 약 100개는 필수 유전자가 아니라고 밝히고, 이를 통해 Minimal genome은 400개 미만(265-350개)의 유전자를 가질 것이라 추측하였다 [10]. 이렇게 확보된 400개 정도의 필수 유전자 목록을 이용하여 화학적으로 DNA조각들을 이어 붙여 Minimal genome을 만드는 작업을 시작했다 (그림 1)[3].

 

[그림 1. Top-down접근을 통한 gene minimizing 6 step]


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2007년부터 2010년까지는 유전체 이식을 중심으로 한 연구를 진행하였는데, 첫 해에는 미생물의 유전체를 서로 다른 종에게 이식 할 수 있다는 것을 증명했다. 2007년 유전체를 제거한 M.capricolum에 M.mycoides의 유전체를 이식하여, 한 종의 Bacteria를 다른 종으로 바꾸는 것을 성공 한다 [10, 11]. 유전체가 이식된 변형된 M.capricolum으로부터 얻어낸 유전체를 시퀀싱한 결과 Bacteria들이 수여자 세포(M.capricolum)가 아닌 공여자 세포(M.mycoides)의 특징을 가진 단백질들을 생산하는 것을 확인했으며, 성장 모습 또한 M.mycoides와 보다 더 유사했다 [9]. 수여자의 유전체가 공여자의 유전체로 대체되는 이 현상은 아직까지 정확하게 그 원인이 밝혀지지 않았다. 하지만 Bacteria의 진화 방법 중 하나인  수평적 유전자 이동, 생식에 의하지 않고 개체에서 개체로 유전형질이 이동되는 현상Horizontal gene transfer의 일종이 아닌가 하는 의견이 있다 [1]. 2008년에는 M. genitalium의 유전자와 일치하는 복사체인 인공합성 유전체를 만들고, 그곳에 인공합성 유전자와 기존에 존재하던 유전자를 구별할 수 있도록 ‘watermark' 염기서열(기능 없는 DNA서열)을 삽입하는 실험을 진행 하였다. 이 watermark는 세포의 생존에는 영향을 미치지 않았다 [2, 5, 9].
 
  그림 2는 초기의 유전자 이식 과정을 보여주고 있다. Bacteria 유전체에 효모의 벡터를 삽입 및 분리하고 이를 효모에 도입시켜 이를 Cloning, 그리고 Genome engineering 과정을 거친 후에 분리하였다. 그리고 Bacteria 내에 Restriction system으로부터 이 유전체를 보호하기 위해 메틸화 작업을 거친 후 공여자 세포에 도입시켜 Engineered bacteria를 생산하였다.


[그림 2. 초기 유전자 이식 과정]


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출처 : Modified from Science. 325(5948):1693-1696 (2009). 


  2010년 5월, Venter는 Science지를 통해 M.mycoides 유전체를 합성하고 조립해서 만든 Minimal cell의 시초인 JCVI-syn 1.0을 발표했다. JCVI는 J. Craig Venter Institute를 따서 이름이 지어졌다. 이는 완전히 합성된 유전체를 가지고 있는 첫 번째 Bacteria였다 [10]
 

 

3. Minimal Cell의 발전 과정


 가. Design-build-test cycle


  JCVI-syn 1.0은 100만개 이상의 DNA 염기로 이루어졌으며, 여전히 불필요한 유전자들을 가지고 있어 ‘Minimal'하지는 않았다. 따라서 불필요한 유전자들을 제거하기 위해 Design-build-test cycle(설계-제작-검증 사이클)을 설계했다. (Design-build-test cycle, 그림 3)


[그림 3. Design-build-test cycle]
 

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출처 : Modified from Science. 351(6280):aad6253 (2016)


  먼저 JCVI-syn 1.0의 901개의 유전자로 이루어진 유전체를 8조각으로 분리했다. 그리고 이들을 쉽게 재조립하기 위해 이 조각들의 처음과 끝에 DNA tag를 붙였다. 이 조각들을 하나의 독립적인 모듈 단위로 하여, 차례로 하나씩 제거한 후 나머지 조각들을 조립(7/8조각)하여 인공 유전체를 합성하였다. 그 후에 M.capricolum에 재 삽입 했을 때 어떠한 조합이 생존할 수 있는 세포를 만드는지 살펴보았다. 만약 세포가 살아있다면 비 필수 유전자(Non-essential gene) 만을 포함한 조각을 잘라낸 것으로 간주하고 실험을 반복했다. 앞의 과정을 통해 8개의 DNA조각 중 필수적인 유전자를 포함한 조각을 선별하고, 조각 내에 존재하는 각 유전자의 필요성을 확인하기 위해 Tn5 돌연변이유발 실험을 진행했다(뒤에서 자세히 다루도록 하겠다) [3].

 

 이 모든 방법들이 비 필수 유전자들과 유사 유전자들을 체계적으로 줄이는 것을 가능하게 했다. 이 방법들을 통해 생성된 유전체는 JCVI-syn1.0, JCVI-syn2.0을 거치면서, 처음 등장했던 JCVI-syn1.0 보다 크기가 반이나 줄어든 JCVI-syn3.0의 초석이 되었다 [11].

 

 나. Tn5 돌연변이유발 실험을 통한 필수 유전자의 구별


 JCVI( J. Craig Venter Institute의 약자)는 ‘생명활동에 필요한 최소한의 유전자만 가지고 있는 유전체’에 다가가기 위해 Design-build-test cycle과 함께 Tn5 돌연변이유발 실험을 시행하여 필수 유전자(Essential gene, e-gene), 비 필수 유전자(Nonessential gene, n-gene)의 구별뿐 아니라 준 필수 유전자(Quasi- essential gene, i-gene)까지 구별해냈다. 준 필수 유전자란, 단백질을 암호화하고 있지는 않지만 성장 장애를 유발하는 요소를 제거함으로써 필수 유전자의 발현을 돕기 때문에 여전히 필요한 유전자이다.

 

  Tn5는 Transposable Tn5의 준말로, RNase의 일종이다. Transposase는 트랜스포손(Transposon)의 말단에 결합해 트랜스포손이 다른 부위의 유전자로 이동하는 것을 촉매 한다. Transposase는 세포 내 치명적인 변이를 일으킬 수 있기 때문에 보통 비활성 상태로 존재한다.  트랜스포손 돌연변이(Transposon mutagenesis)는 숙주 세포의 유전자를 변이시켜 원래의 기능을 잃게 하는 생물학적 현상이다. JCVI는 Tn5를 이용하여 트랜스포손이 유전체 내에 필수 유전자가 있는 부분에 삽입되면 세포가 살아남지 못하고, 비 필수 유전자가 있는 부분에 삽입되면 세포가 여전히 살아있는 현상을 통해 필수 유전자와 비 필수 유전자를 구별해냈다. 트랜스포손이 준 필수 유전자에 삽입되었을 때는 성장이 저해되거나 심각한 손상을 입었다. 트랜스포손이 삽입되었을 때 성장이 저해되는 유전자를 성장 비 필수 유전자 ‘in-genes’, 심각한 손상을 입는 유전자를 성장 필수 유전자 ‘ie-genes’ 라고 명명했다 (그림 4).


[그림 4. Tn5 돌연변이 유발 실험 결과]


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출처 : Modified from Science. 351(6280):aad6253 (2016)


  Tn5 돌연변이유발 실험결과, JCVI-syn1.0에 존재하는 901개의 단백질 암호화 유전자와 RNA 암호화 유전자들 중에 432개는 비 필수 유전자, 240개는 필수 유전자, 229개는 준 필수 유전자로 결론 내려졌다 (그림 4). 이로써, JCVI-syn 1.0의 901개의 유전자 중에서 473개 유전자로 구성된 syn 3.0이 완성되었다. JCVI-syn 1.0에서 3.0까지 보존된 유전자와 삭제된 유전자의 기능 범주를 그림 5의 표로 정리하였다.

 

[그림 5. 보존된 유전자와 삭제된 유전자의 기능 범주]

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출처 : Modified from Science. 351(6280):aad6253 (2016)


다. JCVI-syn 3.0


  2016년 논문에서 소개된 JCVI-syn3.0의 크기는 약 53만 염기쌍에 달하며, 438개의 단백질을 암호화하는 합성 유전자와 35개의 annotated RNA로 이루어졌다고 발표했다. 이는 JCVI-syn1.0에 비해 유전체 크기가 반으로 줄어든 것이며, 세포분열 시간은 3시간, JCVI-syn 1.0과 유사한 형태의 콜로니를 형성하였다 [3].

 

  Syn 3.0은 473개의 유전자를 가지고 있는데, 유전정보 발현에 관련된 유전자 195개(41%), 세포막의 구조와 기능에 관련된 유전자 84개(18%), 세포질 물질 대사에 관련된 유전자 81개(17%), 기능 범주에 속하지 않는 유전자 79개(17%), 유전 정보 보존에 관련된 유전자가 34개(7%)로 밝혀졌다 (그림 6). 79개의 기능 범주에 속하지 않는 유전자 중에서 19개는 필수 유전자(e-genes)이었고, 36개는 준 필수 유전자 또는 성장 필수 유전자(i-genes or ie-genes)이었으며, 24개는 비 필수 유전자 또는 성장 비 필수 유전자(n- genes or in-genes)였다 [3]. 하지만 473개의 유전자 중 149개 유전자의 기능은 밝히지 못하였다.

 

[그림 6. JCVI-syn3.0의 유전체 내 유전자 구성]


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출처 : Modified from Science. 351(6280):aad6253 (2016)

 

4. 결론


  유전체 최소화 과정을 거쳐 만들어진 Minimal cell JCVI-syn3.0은 473개의 유전자를 암호화하는 약 53만개 염기서열을 가지고 있는 유전체로 이루어져 있다 [3]. 100만개 이상의 염기를 가지고 있는 syn1.0에서 Design-build-test cycle과 트랜스포손 삽입을 이용한 Tn5 돌연변이유발 실험을 통해 비 필수 유전자의 90%를 삭제함으로써 유전체의 크기가 50% 가량  줄어든 JCVI-syn3.0에 이르게 되었다. 이는 거듭된 연구를 통해 점점 진정한 ‘Minimal cell'의 모습에 가까워지고 있는 것을 시사한다. 하지만 473개의 유전자 중 기능이 밝혀지지 않은 149개 유전자는 숙제로 남아 있다. 즉 생명을 유지하는데 필요한 유전자중 1/3에 해당하는 유전자의 생명체 유지에 기여하는 역할을 모르는 것이다. 향후 연구에 더 응용된 기술을 적용하여 아직 기능이 확실히 밝혀지지 않은 유전자들의 기능을 정확히 파악한다면, 유전체의 크기를 현재의 JCVI-syn3.0보다 더 줄일 수 있을 것이다. 또한 반드시 필요한 유전자로 이루어진 진정한 Minimal cell이 만들어진다면, 이를 이용한 새로운 유전자의 기능을 밝히는 연구가 활발해 질 것이다.


 
5. 고찰


  90년대에 시작된 인간게놈프로젝트를 통해 과학자들은 인간의 생명활동을 대부분 이해할 수 있을 것이라 예상했었다. 하지만 현재 Bacteria의 필수 유전자 중 1/3에 해당하는 149개의 기능조차도 아직 정확히 파악되고 있지 않다 [3]. 게다가 이 유전자들 중 상당수는 인간을 포함한 다른 생명체에서도 발견된다고 한다.


  Minimal cell은 생명활동을 할 수 있는 가장 작은 유전체를 만드는 데 의미가 있기도 하지만, Minimal cell의 유전체를 바탕으로 아직 기능이 밝혀지지 않은 유전자들을 하나씩 대입시켜보면 이 유전자들의 기능을 알 수 있게 될 것이다. JCVI-syn3.0의 유전자 중 79개의 기능 범주에 속하지 않는 중에서 24개는 비 필수 유전자 또는 성장 비 필수 유전자(n-genes or in-genes)라고 하는데, 이 부분의 유전자 수를 최소화 하는 것이 Minimal cell에 궁극적으로 다가갈 수 있는 방법일 것이다.


  JCVI에서는 Minimal cell이 약물, 연료, 기타 제품들을 만드는 맞춤형 세포를 만드는데 쓰일 것이라고 예상하고 있지만, Minimal cell이 미래에 어떤 분야에 쓰일지는 아무도 알 수 없다. 만약 우수한 유전자의 조합으로 우수한 생명체를 만들고자 하는 욕망이 인간에 적용되어 우수한 유전자만을 가진 인간을 창조한다면, 1997년에 개봉되었던 영화 ‘가타카’ 에 그려진 모습들이 실제로 우리 현실에 재현될지도 모른다. 이러한 우려는 이미 2010년 JCVI-syn1.0을 발표할 당시 Craig Venter는 ‘생명을 창조했다’ 라고 발표하면서 불거졌던 사항이다. 또한 새로 만들어진 세균에 의해 다양한 질병이 유발될 가능성도 충분히 있다. 따라서 이 기술을 어느 분야까지 사용할 것인지, 그리고 규제할 것인지에 대해 신중한 검토가 필요할 것이다.